Se establece la primera línea celular continua de esponjas marinas

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 5766 (2023) Citar este artículo

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El potencial de los productos químicos derivados de las esponjas para aplicaciones farmacéuticas sigue en gran medida sin explotar debido a la limitada biomasa disponible. Aunque muchos han intentado cultivar células de esponjas marinas in vitro para crear una plataforma de producción escalable para dichos productos biofarmacéuticos, estos esfuerzos han sido en su mayoría infructuosos. Recientemente demostramos que las células de la esponja Geodia barretti podían dividirse rápidamente en medio M1. En este estudio establecimos la primera línea celular continua de esponjas marinas, originaria de G. barretti. Las células de G. barretti cultivadas en medio OpM1, una modificación de M1, crecieron más rápidamente y alcanzaron una mayor densidad que en M1. Las células en OpM1 alcanzaron 1,74 duplicaciones de población después de 30 minutos, más del doble que la ya rápida tasa de crecimiento de 0,74 duplicaciones de población en 30 minutos en M1. El número máximo de duplicaciones de población aumentó de 5 duplicaciones en M1 a al menos 98 duplicaciones en OpM1. Las células subcultivadas podrían criopreservarse y utilizarse para inocular nuevos cultivos. Con estos resultados, hemos superado un obstáculo importante que ha bloqueado el camino a la producción de biofármacos con células esponjosas a escala industrial durante décadas.

Aproximadamente el 30% de los miles de productos naturales marinos descubiertos cada año provienen de esponjas y microbios derivados de esponjas1,2,3,4. Las esponjas también contienen componentes estructurales con posibles aplicaciones para la salud humana en ingeniería de tejidos, por ejemplo, como soporte para el crecimiento de implantes óseos5,6,7. Muchos productos derivados de esponjas son candidatos potenciales a fármacos para tratar enfermedades humanas8,9,10, como el cáncer11,12 y las infecciones por virus13, hongos14 y bacterias resistentes a los medicamentos15. Por ejemplo, el avarol, producido por la esponja mediterránea Dysidea avara, tiene un fuerte efecto citostático sobre las células leucémicas16,17 y un compuesto recientemente descubierto de un microbio derivado de la esponja previene el crecimiento y la formación de biopelículas de la bacteria Staphylococcus epidermidis, que representa un riesgo para la salud. pacientes sometidos a cirugía ya que forma biopelículas en implantes y dispositivos médicos18. El organismo modelo utilizado en este estudio, Geodia barretti, produce barettins, una familia de compuestos antiinflamatorios y antioxidantes19. Para una revisión exhaustiva de varios tipos de compuestos bioactivos y sus efectos y estructuras, consulte Han et al. 201920. Si bien su potencial es enorme, los fármacos candidatos derivados de esponjas que se encuentran en diversas etapas de ensayos clínicos enfrentan graves problemas de suministro21. La recolección silvestre es insostenible y muchos compuestos son demasiado complejos para que la síntesis química sea económicamente viable22. Por lo tanto, la mayoría de los esfuerzos para superar los problemas de suministro se han centrado en producir biomasa mediante maricultura22,23,24,25 o cultivo celular22,26,27,28. La maricultura se muestra prometedora en algunos casos24,25, pero el cultivo de células in vitro tiene grandes ventajas: permite un seguimiento y control estrechos de las condiciones y es fácil de optimizar y ampliar. A pesar de los esfuerzos de muchos grupos, durante mucho tiempo sólo se establecieron culturas primarias. Los principales obstáculos en el cultivo de células de esponja fueron los microbios contaminantes y la comprensión limitada de los requisitos condicionales de las células de esponja in vitro26.

Recientemente, informamos que las células de múltiples especies de esponjas podrían dividirse rápidamente en M129, un medio específico para esponjas desarrollado por Munroe et al. en 201930. El medio M1 se basa en el medio M199 definido30, que fue previamente modificado y utilizado para establecer cultivos celulares primarios de varias especies de esponjas27,28,31,32,33. Las concentraciones de aminoácidos se ajustaron mediante múltiples rondas de optimización utilizando un algoritmo genético30. Se observó proliferación en medio M1 para células de esponjas planas de pasto Geodia sp. y Amphimedon erina, la esponja de arrecife Geodia neptuni y la esponja boreal de aguas profundas G. barretti, entre otras especies. Los cultivos de las 3 especies de Geodia se dividieron rápidamente hasta estabilizarse y se pudieron pasar mediante subcultivos hasta 5 veces y alcanzar hasta 7 duplicaciones de población (Nd) dependiendo de la especie. Esta fue la primera pista concreta para desarrollar líneas celulares estables de esponjas marinas29. Si bien estos resultados representaron un gran avance, el número de pases y las duplicaciones de población alcanzadas en el medio M1 no producen suficiente biomasa para producir compuestos a escala industrial. Para mejorar estas características de crecimiento de las células esponjosas in vitro, se utilizó el medio M1 como base para optimizar otros componentes como vitaminas, suero fetal bovino y varios factores de crecimiento (Tabla 1), utilizando el mismo algoritmo genético que se utilizó para desarrollar el medio M130. . Esto dio como resultado una nueva composición de medio, OpM1. Con el objetivo de proporcionar una prueba del concepto de que una línea celular de esponja podría ampliarse para producir compuestos bioactivos in vitro, probamos si las células de G. barretti cultivadas en medio OpM1 tenían una mayor tasa de crecimiento, una densidad celular máxima y un número máximo de duplicaciones de población, debido a los componentes adicionales.

Para comparar las células esponjosas que proliferan en M1 y OpM1, se midió el crecimiento de células de 3 individuos de G. barretti en ambos medios (Fig. 1). Estos individuos eran 3 individuos diferentes a los utilizados en nuestro estudio anterior29. Las células de 3 individuos de G. barretti cultivadas en M1 alcanzaron 0,74 duplicaciones de población (Nd) (de 3,0E+06 a 5,0E+06 ± 5,9E+05 células/mL) después de 30 min, donde las células cultivadas en OpM1 alcanzaron Nd = 1,74 (de 3,0E+06 a 1,0E+07 ± 9,9E+05 células/mL) en el mismo periodo (Fig. 1). Las células de 3 individuos de G. barretti en M1 alcanzaron una densidad máxima de 6,4E+06 ± 5,4E+05 células/mL en promedio dentro de las 5 h posteriores a la inoculación (Fig. 1), mientras que las células en el medio OpM1 alcanzaron una densidad significativa (p = 1.6E−10) mayor densidad de 1.2E+07 ± 2.3E+05 células/mL después de solo 2 h (Fig. 1). Después de alcanzar sus respectivas mesetas, las células permanecieron en la misma densidad hasta el final del cultivo (t = 48 h) en ambos medios, con densidades celulares finales promedio de 6,9E+06 ± 1,2E+05 en M1 y un valor significativamente mayor. de 1,3E+07 ± 3,0E+05 células/mL (p = 5,7E−14) en OpM1 (Fig. 1).

Curvas de crecimiento de células de G. barretti de 3 individuos, cultivadas en medios M1 y OpM1. Las barras de error indican la desviación estándar del promedio de réplicas biológicas (N = 3) y técnicas (n = 3).

OpM1 contiene 13 componentes adicionales en comparación con M1 (ver Tabla 1): cóctel de factores de crecimiento 1 (GF1), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), pifitrina-α (PFTα), suero fetal bovino (FBS), insulina-transferrina-selenio. -etanolamina (ITS-X), mezcla de lípidos-1 (LM-1), solución de vitaminas 1 (Vit1, que consiste en ascorbato de sodio (SA) y piruvato de sodio (SP)), solución de oligoelementos (TE, que consiste en metasilicato de sodio y sulfato de zinc) y la solución vitamínica 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Los efectos de cada componente se evaluaron comparando el crecimiento de células de 1 individuo de G. barretti en un conjunto de medios, en cada uno de los cuales estaba ausente un componente diferente, utilizando medios OpM1 y M1 como controles. El impacto de omitir los diferentes componentes en la densidad celular máxima varió (Fig. 2).

Impacto de los componentes adicionales en OpM1 en la curva de crecimiento de células de G. barretti de 1 individuo. Las células se cultivaron en diferentes composiciones de medios OpM1, en cada una de las cuales se reemplazó un componente por dH2O estéril. (A) OpM1-PFTα, -PDGF o -GF1, (B) OpM1-ITS-X, -LM-1 o -FBS, (C) OpM1-Vit1, -TE o -RPMI. OpM1 y M1 se utilizaron como controles. Las barras de error indican la desviación estándar del promedio de réplicas técnicas (n = 3).

Sin GF1, que consta de factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-1) y fitohemaglutinina (PHA) (Tabla 1), la curva de crecimiento fue la misma que en el medio M1 (Fig. 2A). . Cuando se probaron PHA, IGF-1 y EGF por separado, todas las composiciones de medio sin PHA se comportaron como M1, mientras que la composición con PHA no mostró diferencias con el control OpM1 (Fig. S1A). El efecto del PHA sobre la densidad celular dependía de la dosis: concentraciones inferiores al 75% de la concentración de PHA en OpM1 disminuyeron la densidad final de las células de G. barretti (Fig. S2A). Las concentraciones de PHA superiores al 100% (hasta el 800%) no aumentaron la densidad celular final en comparación con OpM1 (Figura S2B). La ausencia del pequeño inhibidor químico de la apoptosis PFTα34 o FBS redujo la densidad celular en comparación con el control OpM1 después de 6 h, y después de 24 h la densidad había disminuido al mismo nivel que en el control M1 (Fig. 2A, B). Cuando se omitió Vit1, la densidad final disminuyó significativamente en comparación con OpM1 (Fig. 2C). Las células cultivadas en OpM1 sin Vit1 pero con cualquiera de sus componentes, SA y SP (Tabla 1), alcanzaron una densidad menor que en OpM1 después de 6 h, pero después de 24 h la diferencia con OpM1 ya no fue significativa (Figura S1B). En OpM1 sin PDGF, LM-1, ITS-X o RPMI, se observó una disminución modesta pero significativa en la densidad celular (Fig. 2A-C). TE no afectó significativamente la densidad final alcanzada por las células de G. barretti cuando se omitió (Fig. 2C).

Se llevaron a cabo experimentos de subcultivo en medios M1 y OpM1 a 4 °C para determinar el número máximo de duplicaciones de población (Ndmax) y pases que pueden alcanzar las células de 3 individuos de G. barretti. En medio M1, las células subcultivadas dos veces por semana se dividieron hasta el quinto pase (P5) (Fig. 3). Las células de 3 individuos de G. barretti cultivadas en medio M1 alcanzaron en promedio Ndmax = 5,1 ± 0,9 duplicaciones de población en 5 pases (Fig. 4). El Nd por pase fue el más alto en los primeros 3 pases y el Nd acumulativo luego se estabilizó, con solo aumentos menores en el número de células en los últimos 2 pases (Figs. 3 y 4). Por el contrario, para las células de G. barretti cultivadas en OpM1, el Nd por pase fue casi constante en 1,8 ± 0,02 en 19 pases. Después de P19, las densidades celulares aumentaron durante 3 pases, luego disminuyeron y las células dejaron de crecer después de 25 pases y Nd = 46,9 ± 0,7 (Fig. 3). Se usaron células criopreservadas en el momento del pase 16 para inocular medio OpM1 (OpM1_P16). Este nuevo cultivo fue subcultivo 30 veces y alcanzó Nd = 98,4 ± 0,8 (Fig. 4). Las células de G. barretti en OpM1 continuaron dividiéndose y el Ndmax aún está por determinar. En cada pase, se criopreservaba una porción de las células para crear un banco de células para su uso en experimentos futuros.

Pasaje de células de G. barretti cultivadas en medios M1 y OpM1. OpM1_P16 representa cultivos celulares reiniciados a partir de células criopreservadas en el paso 16. Las barras de error indican la desviación estándar del promedio de réplicas biológicas (N = 3) y técnicas (n = 3).

Duplicaciones de población acumuladas (Nd) de células de 3 individuos de G. barretti cultivadas en M1 y OpM1 en 5 y 25 pases, respectivamente. OpM1_P16 muestra duplicaciones realizadas por células criopreservadas después del pase 16 y utilizadas para iniciar un nuevo cultivo en OpM1, que continuó durante al menos 30 pases más (46 pases en total). Las barras de error indican la desviación estándar del promedio de réplicas biológicas (N = 3) y técnicas (n = 3).

En los primeros 2 pases (P1, P2), las densidades alcanzadas entre las células de 3 individuos de G. barretti cultivados en M1 variaron significativamente. En P1, las células de 1 individuo (GB1) alcanzaron 5,9E + 06 ± 3,6E + 05 células/mL, mientras que los otros 2 individuos alcanzaron densidades celulares superiores de 1,0E+07 ± 6,6E+05 (GB2) y 8,1E. +06 ± 5,1E+05 células/mL (GB3), respectivamente. Un patrón similar se observó en P2, donde estos individuos alcanzaron densidades celulares de 6.4E+06 ± 2.9E+05 (GB1), 9.8E+06 ± 4.6E+05 (GB2) y 7.7E+06 ± 4.5E+ 05 (GB3) células/mL, respectivamente. Aunque este patrón de variación individual no se observó en P3 y P4, sí ocurrió en P5. Cabe señalar que las densidades iniciales se calcularon, en lugar de contarse, dividiendo la densidad celular contada por el factor de dilución. Esto también podría explicar parcialmente las variaciones en las densidades celulares iniciales y finales entre muestras. Las células en el medio OpM1 alcanzaron densidades más altas que las del M1 con poca variación individual (Fig. 3).

Se utilizó la secuenciación del gen 18S rRNA antes de la inoculación (P0) y después de 19 pases (P19) para confirmar que las células que crecían en cultivo eran células de G. barretti. En P0, todas las secuencias tenían el vale ZMBN de Geodia barretti: 77922 gen 18S rRNA (número de acceso de NCBI Genbank KC481224.1) como mejor coincidencia (97-100% de identidad). Aunque se descartaron tres muestras de P19 debido a un número demasiado bajo de lecturas obtenidas (<300), de cada una de las muestras de G. barretti al menos una muestra de P19 tuvo éxito. Dos muestras de P19, Gb1_P19_2 y Gb2_P19_3, contenían una pequeña fracción de células de Komagataella phaffii (levadura), pero era menos del 1,3%. Todas las demás lecturas identificadas como 18S rRNA en las muestras P19 correspondieron al vale de Geodia barretti ZMBN:77922 gen 18S rRNA (97-100% de identidad) (Fig. 5A). Los rendimientos de extracción de ADN fueron bajos para las muestras P19 (30 ng/1,0E+08 células en promedio) en comparación con las muestras P0 (500 ng/1,0E+08 células en promedio) que se extrajeron directamente de los bancos de células. Otra diferencia notable entre P0 y P19 fue que de las muestras de P19 un promedio del 22,3% de las lecturas (± 23,7%) obtenidas no arrojaron ningún impacto explosivo o arrojaron un impacto que no era el gen 18S rRNA (Fig. 5B). Sin embargo, la identidad de secuencia para todas las lecturas con una coincidencia del gen ARNr distinto del 18S fue inferior al 92%; estos se derivaban de peces (salmón, carpa), tomate y una bacteria (Novospingobium pentaromativorans). No está claro de qué se derivan estas secuencias, pero pueden estar relacionadas con componentes de medios que contienen ADN, como FBS. Sin embargo, no hay indicios de contaminación sustancial de la línea celular de G. barretti con otras células eucariotas en P19.

Composición de la comunidad eucariota de cultivos celulares de G. barretti. (A) Distribución de genes de ARNr 18S en cultivos de células de G. barretti de los bancos de células (t0) y después del paso 19 (P19) separados por la línea discontinua. (B) Distribución de secuencias del gen 18S rRNA y otras secuencias que se generaron a partir de los bancos de células (t0) y después del paso 19 (P19). La leyenda de colores indica el mejor acierto de Blastn obtenido y entre paréntesis el porcentaje de identidad.

Establecimos la primera línea celular continua de esponjas marinas, procedente de la esponja boreal de aguas profundas G. barretti. Anteriormente informamos que las células de múltiples especies de esponjas, incluida G. barretti, se dividían rápidamente en medio M1 y podían mantenerse hasta por 5 pases y 7 duplicaciones de población29. En este estudio, comparamos el crecimiento de células de G. barretti en medio M1 optimizado con aminoácidos30 y su medio derivado OpM1 que contiene concentraciones optimizadas de nutrientes adicionales como factores de crecimiento, lípidos, vitaminas y oligoelementos, entre otros (Tabla 1).

OpM1 aumentó significativamente la tasa de crecimiento y la densidad celular máxima alcanzada por las células de G. barretti en cultivo, reduciendo el ya corto tiempo de duplicación de menos de 1 h en medio M1 a menos de 30 minutos en OpM1. Los tiempos de duplicación en otras células animales suelen ser mucho más prolongados; por ejemplo, las células de ovario de hámster chino (CHO) se dividen una vez cada 20 a 24 h. Sin embargo, se sabe que las células de esponja proliferan rápidamente in situ35,36: en 6 h, el 70,5 % de todos los coanocitos de la esponja Mycale microsigmatosa habían incorporado bromodesoxiuridina marcada (BrdU) mientras replicaban su genoma antes de dividirse35. Las células esponjosas poseen los mismos genes que regulan e impulsan el ciclo celular en todos los demás animales37. Las diferencias en estos genes entre las esponjas y otros animales, y/o genes o mecanismos aún desconocidos, podrían haber aumentado la velocidad de la maquinaria de replicación de las esponjas. También es posible que las células esponjosas no necesiten replicar su genoma antes de dividirse cuando se colocan por primera vez en medio M1 u OpM1. Por ejemplo, G. barretti podría poseer grupos de células tetraploides (cuatro copias del genoma) que se dividen rápidamente cuando el animal sufre daño, como se encontró en otros invertebrados, incluido el pólipo de agua dulce Hydra attenuata38 y la medusa invertida Cassiopea sp39. Estas poblaciones de células podrían ser responsables del potencial de las esponjas para "curarse" rápidamente después de un daño mecánico40,41, aunque no se observó una acumulación significativa de células tetraploides en dos especies de esponjas de agua dulce42. Investigar cómo progresa el ciclo celular de G. barretti en múltiples pasajes y cuántas copias del genoma tienen las células antes y después de dividirse podría arrojar luz sobre cómo las células esponjosas proliferan tan rápidamente.

El número máximo de duplicaciones de población que las células de G. barretti podrían alcanzar aumentó de 5 duplicaciones en M1 a al menos 98 duplicaciones en OpM1. Las células que fueron criopreservadas después del paso 16 se usaron para inocular nuevos cultivos que podrían subcultivarse al menos 30 veces más, lo que demuestra que la línea celular establecida se puede almacenar en un banco de células para futuras investigaciones. La línea celular de G. barretti continuó dividiéndose en OpM1; Actualmente, nuestro grupo está investigando si el número de duplicaciones que puede alcanzar la línea celular es limitado o si las células de G. barretti son naturalmente inmortales. En los seres humanos y en la mayoría de los demás animales, las células somáticas pueden dividirse un número limitado de veces antes de volverse senescentes43. Este llamado límite de Hayflick se encuentra entre 40 y 60 divisiones en las células humanas44 y se debe al acortamiento de los telómeros protectores en los extremos de los cromosomas con cada replicación. Una vez que se alcanza una longitud crítica, el genoma se vuelve inestable y la respuesta al daño del ADN detiene el ciclo celular45. Este mecanismo detiene la división celular incontrolable en organismos multicelulares y es en parte responsable del envejecimiento biológico43. Las esponjas46 se encuentran entre una serie de animales invertebrados marinos, incluidas las langostas47, las vieiras48 y las medusas49, que se sabe que mantienen la actividad de la telomerasa en sus células somáticas, independientemente de su edad. Por lo tanto, no sería sorprendente saber que la línea celular de G. barretti es naturalmente inmortal. Comparar la longitud de los telómeros en células de diferentes pasajes podría proporcionar una respuesta a esta pregunta.

Nuestros resultados muestran que todas las adiciones a OpM1, excepto la solución TE, EGF e IGF-1, contribuyeron a su rendimiento superior en comparación con M1, pero el impacto de cada componente varió. PHA fue primordial para la diferencia entre OpM1 y M1, lo que está en línea con informes anteriores de proliferación inducida por PHA en células de otras esponjas marinas, Axinella corrugata33 e Hymenidacidon heliophila27. Las concentraciones de PHA más altas que en OpM1 no aumentaron aún más la densidad celular, lo que sugiere que otros factores limitan la densidad celular máxima en los cultivos de G. barretti. Un pequeño inhibidor químico de la apoptosis mediada por p5334 PFTα y FBS también tuvieron un gran impacto, y la eliminación de estos componentes redujo el crecimiento de las células de G. barretti de manera similar. Después de 6 h, las células de G. barretti cultivadas en OpM1 sin ninguno de los componentes alcanzaron densidades entre M1 y OpM1. Después de 24 h, la densidad celular había disminuido al mismo nivel que en M1. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que PFTα y FBS juntos pueden prevenir la apoptosis en las células de G. barretti. Estos resultados proporcionan los primeros conocimientos sobre nutrientes específicos y componentes del medio necesarios para mantener las células de esponja in vitro. Sin embargo, se necesitan más pruebas para comprender completamente el efecto de los diferentes componentes de OpM1 en el crecimiento de las células de G. barretti y aprender cómo afectan la cantidad de veces que las células de G. barretti pueden dividirse.

Se ha observado una fuerte variación entre especies en esponjas29 y queda por determinar si el medio OpM1 puede soportar células de especies distintas a G. barretti en cultivos in vitro a largo plazo. Cada especie reaccionará de manera diferente a ciertos componentes del medio y condiciones de cultivo hasta cierto punto, como lo ilustran las diferencias entre células de 12 especies diferentes de esponjas cultivadas en medio M1 en nuestro trabajo anterior29. Además, tanto el medio M130 como el OpM1 se optimizaron para la esponja caribeña D. etheria (datos no publicados), en la que aumentó significativamente la actividad metabólica pero no estimuló la división de las células. Es necesario considerar la variación individual al seleccionar el material de origen29,30,50, incluso para especies con baja variación individual como G. barretti29. Nuestros resultados muestran que las células del mismo individuo pueden responder de manera diferente en experimentos separados bajo las mismas condiciones de cultivo. Si bien esto podría deberse a que los diferentes lotes de medios y crioviales varían ligeramente, sería beneficioso repetir los experimentos de (sub)cultivo al examinar especies e individuos de esponjas. Otro factor a considerar es la presencia y concentración de compuestos de interés, o quimiotipo de esponja, que varía ampliamente entre especies y también entre individuos debido a factores ecofisiológicos y estacionales51,52. En resumen, desarrollar una cepa de producción para cualquier metabolito en particular requerirá una selección cuidadosa del material de origen y una optimización específica de las condiciones del medio y del cultivo29.

Los cultivos de células de esponjas in vitro se pueden utilizar como sistemas modelo para probar una amplia variedad de hipótesis sobre la biología celular y cómo los primeros animales evolucionaron a partir de organismos unicelulares y desarrollaron relaciones simbióticas con microbios. Los enfoques metabolómicos pueden ayudar a identificar vías que sintetizan metabolitos secundarios como los barettins. Cuando dichos compuestos son producidos por la propia esponja, las líneas celulares de esponja se pueden utilizar directamente como plataforma de producción. En los casos en que los microbios simbióticos produzcan los compuestos, se pueden utilizar líneas celulares de esponjas para establecer cocultivos con estos microbios y crear una plataforma de producción. La línea celular continua de G. barretti presentada aquí permite pasos futuros para explotar el enorme potencial de los compuestos bioactivos derivados de esponjas.

Establecimos la primera línea celular continua de esponjas marinas, procedente de la esponja boreal de aguas profundas G. barretti, mediante el cultivo de células en medio OpM1. Este derivado del medio M1 con nutrientes agregados aumentó la tasa de crecimiento, la densidad celular máxima y el número máximo de duplicaciones de la población de células de G. barretti in vitro. PHA fue el componente agregado más importante en OpM1, mientras que PFTα y FBS también tuvieron grandes impactos. Nuestros resultados pueden servir como modelo para establecer líneas celulares para otras especies de esponjas. La variación interespecífica e intraespecífica (individual) hace que la selección cuidadosa del material de origen y la optimización específica del medio de cultivo para especies y aplicaciones sean esenciales para desarrollar líneas celulares de esponjas. Las líneas celulares de G. barretti y otras especies de esponjas pueden producir constantemente suficiente biomasa para desarrollar plataformas de producción a pequeña escala y suministrar compuestos farmacéuticamente relevantes para estudios de ensayos clínicos. La producción de productos biofarmacéuticos con células esponjosas a escala industrial está ahora un paso más cerca de convertirse en realidad.

Tres individuos de Geodia barretti (Filo Porifera, Clase Demospongiae, Orden Tetractinellida, Familia Geodiidae) fueron recolectados del fondo del océano en un solo arrastre a una profundidad de ~ 500 m en un fiordo cerca de Bergen, Noruega (59°58.8″N 5 °22,4″E). Las células se disociaron exprimiendo fragmentos de la esponja a través de una gasa estéril (B. Braun Medical, malla de grado 16) y la suspensión celular resultante se pasó a través de un filtro de 40 µm para eliminar los desechos. Siguieron dos pasos de lavado, cada uno de los cuales consistió en centrifugación a 300 × g durante 5 minutos y resuspensión del sedimento en ASW. Las células se contaron microscópicamente utilizando hemocitómetros (C-Chip™ Neubauer Mejorado, NanoEnTek) para determinar las concentraciones celulares. Las células se centrifugaron una vez más a 300 x g durante 5 minutos y se resuspendieron en crioprotector (10% de suero bovino fetal (FBS) y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) en ASW) a una densidad de aproximadamente 1,0E + 08 células/ml. Se colocaron alícuotas de 1 ml de suspensión celular en viales criogénicos dentro de recipientes de congelación Nalgene® Mr. Frosty, que enfriaron la suspensión celular a una velocidad constante de 1 °C/minuto cuando se colocaron a -80 °C.

Las composiciones de los medios de cultivo M130 y OpM1 fueron las descritas en la Tabla 1, donde se pueden encontrar las concentraciones stock y finales, el fabricante y el número de catálogo de cada componente. Las soluciones salinas agregadas al polvo M199 en dH2O dieron como resultado una osmolalidad final y una composición de sal cercana a la del agua de mar (≈1000 mOsm). A continuación, se agregaron soluciones madre para cada aminoácido para alcanzar la concentración final deseada. Antes de la adición final de dH2O, antimicrobianos (30 µg/ml de rifampicina y 3 µg/ml de anfotericina B) e ingredientes adicionales de OpM1, se almacenaron alícuotas del medio a -20 °C durante hasta 1 mes. Cuando se necesitaba medio, una alícuota descongelada se complementó con dH2O y antimicrobianos para preparar el medio M1, o con dH2O, antimicrobianos y los demás ingredientes necesarios para elaborar OpM1. El pH final de ambos medios fue ≈8,2, similar al pH del agua de mar. Las concentraciones de los componentes en M1 y OpM1 durante la preparación del medio se ajustaron para tener en cuenta la dilución mediante la adición del inóculo, dH2O y antimicrobianos. El inóculo siempre representó 1/16 del volumen total del cultivo y contenía 16 veces la densidad de inoculación (3,0E + 06 células/mL): 4,8E + 07 células/mL en ASW.

Para caracterizar el crecimiento de células de G. barretti en medios M1 y OpM1, se cultivaron células de tres individuos de G. barretti a 4 ° C durante 2 días (t = 48 h). Las células criopreservadas de cada individuo se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 50 °C y luego se transfirieron a tubos Eppendorf de 1,5 ml. Las células se lavaron dos veces en ASW mediante centrifugación a 300 x g durante 5 min, eliminación del sobrenadante y posterior resuspensión en 1 ml de ASW. Las concentraciones celulares se obtuvieron utilizando hemocitómetros desechables (C-Chip™ Neubauer Mejorado, NanoEnTek). La suspensión celular utilizada para inocular el cultivo fue 1/16 del volumen de cultivo final y siempre contuvo 4,8E + 07 células/mL en ASW, para obtener una densidad celular inicial de 3,0E + 06 células/mL. La dilución de los componentes del medio mediante la adición del inóculo se consideró durante la preparación del medio, de modo que la concentración final de cada componente fue la descrita en la Tabla 1 después de la adición del inóculo. Las células se contaron microscópicamente cada hora durante las primeras 6 h, luego después de 24 y 48 h. A partir de una suspensión celular constantemente mezclada, se prepararon triplicados de cultivos de 250 µL (≈ 3,0 + células E06/mL) en placas de 48 pocillos (CELLSTAR®, Greiner Bio-one, Cat. No. 677180) para cada punto temporal (8 veces puntos por individuo).

Se cultivaron células de tres individuos de G. barretti a 4 °C por triplicado en placas de 48 pocillos (CELLSTAR®, Greiner Bio-one, Cat. No. 677180), con 250 µL de suspensión celular por pocillo y una densidad de siembra de 3,0+. E06 células/mL. Los cultivos se pasaron cada 3 o 4 días. Las células que se adhirieron al fondo del pocillo se resuspendieron en el medio gastado pipeteando hacia arriba y hacia abajo, luego las concentraciones celulares se determinaron microscópicamente, como se describió anteriormente. Posteriormente, parte de la suspensión celular se mezcló con medio M1 u OpM1 fresco para diluir nuevamente a la densidad inicial en un volumen total de 250 µL por pocillo. Esto se continuó hasta que las células ya no se dividían para determinar el número máximo de duplicaciones de población de los cultivos en cada medio.

Las células restantes después del subcultivo en OpM1 se criopreservaron para crear un banco de células para cada pase. Se utilizó el método descrito en la sección 'Recolección, disociación y criopreservación de muestras', excepto que se usó OpM1 en lugar de ASW en el crioprotector (con 10% FBS y 10% DMSO) y la densidad celular fue menor, alrededor de 1,0E + 07. células/mL. Para iniciar un nuevo cultivo a partir de las células criopreservadas en el banco de células, se descongelaron células de 1 individuo de G. barretti y se lavaron dos veces con ASW, siguiendo el protocolo descrito en 'Caracterización del crecimiento'. Luego se inocularon las células por triplicado en placas de 48 pocillos (CELLSTAR®, Greiner Bio-one, Cat. No. 677180), con 250 µl de suspensión celular por pocillo y una densidad de siembra de 3,0 + células E06/ml, y se subcultivaron siguiendo las método descrito anteriormente.

Para verificar la identidad de las células en cultivo, se evaluó la composición de la comunidad eucariota a partir de cultivos celulares de los tres individuos de G. barretti después del pase 19, cada cultivo celular por triplicado. Además, se caracterizó la composición de la comunidad eucariota a partir de muestras de bancos de células por triplicado de los mismos individuos. El ADN se extrajo de todas las muestras utilizando el kit FastDNA SPIN para suelo (MP Biomedicals, Irvina, CA, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante y utilizando un sedimento obtenido centrifugando una suspensión celular que contenía 1E8 células (según el recuento de células) como material de partida. La concentración del ADN extraído se determinó con un espectrofotómetro Nanodrop 1000 (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, EE. UU.) y su integridad se examinó mediante electroforesis en gel en un gel de agarosa al 1% (p/v). El ADN extraído se disolvió en tampón TE y se almacenó a -20 °C hasta la amplificación por PCR. La amplificación de la región v7-v8 de los genes 18S rRNA se realizó según Naim et al.53 con la modificación de que se aplicó un enfoque de PCR de 2 pasos. Brevemente, en el primer paso de la PCR, se agregaron los cebadores FF390 (CGATAACGAACGAGACCT) y FR1 (ANCCATTCAATCGGTANT)54 al extremo 3' de Unitag1 y Unitag2, respectivamente55. El primer paso de la PCR se realizó como en Naim et al., pero con 25 en lugar de 30 ciclos de amplificación53. Posteriormente, el primer producto de PCR se utilizó como plantilla en una segunda PCR para agregar códigos de barras específicos de la muestra. La segunda PCR (5 ciclos de amplificación), la limpieza de la PCR y la preparación de una mezcla equimolar de todas las muestras se realizaron como lo describen Dat et al.55. Las muestras se secuenciaron en una plataforma Illumina HiSeq en Novogene (Cambridge, Reino Unido).

Los datos de secuenciación de Illumina se procesaron y analizaron utilizando el proceso NG-Tax56. Brevemente, se combinaron bibliotecas de extremos emparejados y solo se conservaron los pares leídos con cebadores y códigos de barras que coincidían perfectamente. Con este fin, ambos cebadores tenían códigos de barras para facilitar la identificación de las quimeras producidas durante la generación de la biblioteca después de la combinación de productos de PCR individuales. Tanto las lecturas directas como las inversas se recortaron a 100 pb y se concatenaron para producir secuencias de 200 pb. La demultiplexación, la selección de variantes de secuencia de amplicones (ASV), la eliminación de quimeras y la asignación taxonómica se realizaron en un solo paso utilizando el script ASV_picking_pair_end_read en NG-Tax. Las lecturas se clasificaron por muestra por abundancia y los ASV (a un nivel de identidad del 100%) se agregaron a una tabla de ASV inicial para esa muestra comenzando desde la secuencia más abundante hasta que la abundancia fue inferior al 0,1%. La tabla ASV final se creó agrupando las lecturas que se descartaron inicialmente porque representaban ASV <0,1 % de la abundancia relativa con los ASV de la tabla ASV inicial con un umbral de (98,5 % de similitud). Las muestras con <300 lecturas se eliminaron del análisis y para todos los ASV con una abundancia relativa general > 0,2 % y los ASV con una abundancia relativa > 1 % en al menos una muestra a la que se asignó la taxonomía mediante voladura (Blastn), los ASV contra el nr /nt Base de datos NCBI el 7 de marzo de 2021. Las visitas se ordenaron según la puntuación total más alta.

Los datos de secuenciación se depositaron en el archivo de lectura de secuencias del NCBI con el ID de BioProject: PRJNA765353 con números de acceso: SAMN21554876-SAMN21554890. Otros conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Esta investigación fue apoyada por el Proyecto SponGES Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención No. 679848) (a DS, SP, DM), la Beca Marie Curie de la Unión Europea (ITN-2013-BluePharmTrain-607786) (a DS), el Puerto Sucursal de la Fundación del Instituto Oceanográfico, Programa de Licencia de Especialidad de Acuicultura y Save Our Seas (a SP) y la Administración Nacional Oceánica y Atmosférica, Instituto Cooperativo para la Exploración, Investigación y Tecnología Oceánicas (número de concesión NA14OAR43202600 (a SP). Este documento refleja únicamente la opiniones de los autores; los patrocinadores no son responsables del uso que pueda hacerse de la información que contiene. Recordamos con gratitud al Dr. Hans Tore Rapp (Universidad de Bergen) por su liderazgo en el Proyecto SponGES, su incansable optimismo, amabilidad y disposición para Ayúdenos a nosotros y a otros colegas, por ejemplo, recolectando y transportando muestras vivas de Geodia barretti utilizadas en este artículo. Que su memoria continúe inspirándonos.

Ingeniería de bioprocesos, Universidad e Investigación de Wageningen, Wageningen, Países Bajos

Kylie Hesp, Jans ME van der Heijden, Stephanie Munroe, Dirk E. Martens, René H. Wijffels y Shirley A. Pomponi

Instituto Oceanográfico Harbor Branch, Florida Atlantic University, Fort Pierce, FL, EE. UU.

Stephanie Munroe y Shirley A. Pomponi

Laboratorio de Microbiología, Universidad e Investigación de Wageningen, Wageningen, Países Bajos

Detmer Sipkema

Facultad de Biociencias y Acuicultura, Universidad del Norte, Bodø, Noruega

René H. Wijffels

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KH concibió, diseñó y realizó experimentos, analizó datos, preparó figuras para el artículo y escribió el artículo. JH diseñó y realizó experimentos de componentes medianos, analizó datos y revisó borradores del artículo. SM concibió, diseñó y realizó experimentos para optimizar la composición del medio M1 y desarrollar el medio OpM1. DM concibió y diseñó experimentos, analizó datos, contribuyó con reactivos, materiales y herramientas de análisis y revisó borradores del artículo. DS concibió y diseñó experimentos, analizó datos, contribuyó con reactivos, materiales y herramientas de análisis y revisó borradores del artículo. RW concibió y diseñó experimentos, contribuyó con reactivos, materiales y herramientas de análisis y revisó borradores del artículo. SP concibió, diseñó y realizó experimentos, supervisó la investigación, analizó datos, contribuyó con reactivos/materiales/herramientas de análisis y contribuyó y revisó borradores del artículo.

Correspondencia a Kylie Hesp.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Hesp, K., van der Heijden, JME, Munroe, S. et al. Se establece la primera línea celular continua de esponjas marinas. Representante científico 13, 5766 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32394-x

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Recibido: 09 de septiembre de 2022

Aceptado: 27 de marzo de 2023

Publicado: 08 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32394-x

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